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14.4: Warum es wichtig ist - Genexpression - Biologie

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Warum die Regulation der Genexpression erklären?

Krebs ist eine der zehn häufigsten Todesursachen in den Vereinigten Staaten. Mutationen können auch die Wachstumsrate oder das Fortschreiten der Zelle durch den Zellzyklus verändern.

Somit kann Krebs als eine Krankheit mit veränderter Genexpression beschrieben werden. Veränderungen auf jeder Ebene der eukaryontischen Genexpression können zu einem bestimmten Zeitpunkt in irgendeiner Form von Krebs nachgewiesen werden. Um zu verstehen, wie Veränderungen der Genexpression Krebs verursachen können, ist es wichtig zu verstehen, wie jede Phase der Genregulation in normalen Zellen funktioniert. Durch das Verständnis der Kontrollmechanismen in normalen, nicht erkrankten Zellen wird es für Wissenschaftler einfacher zu verstehen, was bei Krankheitszuständen, einschließlich komplexer Zustände wie Krebs, schief läuft.


Systemische Metabolic-Engineering-Strategien zur Produktion von Aminosäuren

Systems Metabolic Engineering ist ein multidisziplinäres Gebiet, das Systembiologie, Synthetische Biologie und Evolutionäres Engineering integriert. Es ist ein effizienter Ansatz zur Stammverbesserung und Prozessoptimierung und wurde erfolgreich bei der mikrobiellen Produktion verschiedener Chemikalien, einschließlich Aminosäuren, angewendet. In dieser Übersicht werden systemische Metabolic-Engineering-Strategien, einschließlich pfadorientierter Ansätze, systembiologischer Ansätze, evolutionärer Ansätze und ihrer Anwendungen in zwei wichtigen Aminosäuren produzierenden Mikroorganismen, behandelt: Corynebacterium glutamicum und Escherichia coli, sind zusammengefasst.


Hintergrund

Pflanzenhormone gelten als wichtige Determinanten des Gesamtwachstums und der Entwicklung der Pflanze. Es wurde gezeigt, dass mehrere Pflanzenhormone wie Auxin, Cytokinin (CK), Gibberelline (GA) und Brassinosteroide (BR) Schlüsselfunktionen bei der Regulierung verschiedener Entwicklungsprozesse wie Samen- und Fruchtentwicklung, Spross- und Wurzelarchitektur ausüben [1]. Mit dem Fortschritt in der Vorwärts- und Rückwärtsgenetik gibt es jetzt ein gutes Verständnis dafür, wie diese Hormone wahrgenommen und die Schlüsselakteure in ihren Signalwegen identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurden Pflanzenhormone und ihre Signaltransduktionsnetzwerke umfassend untersucht und eingesetzt, um eine nachhaltige Landwirtschaft wie Stängelverlängerung, Blütezeit und Prozesse wie die Stickstoffnutzungseffizienz zu verbessern [2]. Interessanterweise werden diese Effekte auf die Wachstumsregulation durch wechselwirkende Signalwege zwischen Pflanzenhormonen kontrolliert. Diese Interaktion ist entweder antagonistisch, synergistisch oder erfolgt parallel [3]. Zum Beispiel werden Prozesse wie die Samenkeimung, das Spross- und Wurzelwachstum und die Kornfüllung durch die antagonistische Beziehung zwischen Abscisinsäure (ABA) und Ethylen (ET) in Mais bestimmt [4]. Darüber hinaus zeigen Auxin und Cytokinin während der Bildung des Wurzelspitzenmeristems einen Antagonismus, wirken aber während der Sprossspitzenmeristembildung synergetisch [5].

Melatonin (MT) ist ein indolisches Molekül, das ubiquitär in allen lebenden Organismen vorkommt. Melatonin in Pflanzen ist mit Wachstum und Entwicklung verbunden, wie zum Beispiel Blatt- und Wurzelorganogenese, Seneszenz und Blüte [6,7,8,9]. Darüber hinaus mildert Melatonin auch eine Vielzahl von abiotischen und biotischen Stressfaktoren in Pflanzen wie Kälte, Trockenheit, Hitze und Infektionen durch den Pilzerreger Diplocarpon mali, biotrophe und hemibiotrophe Bakterien Xanthomonas oryzae und Pseudomonas syringae DC3000 bzw. [10,11,12,13,14,15]. Bis heute gilt Melatonin als wachstumsregulierender Sekundärmetabolit in Pflanzen, neuere Studien deuten jedoch darauf hin, dass es auch das Potenzial hat, ein Pflanzenhormon zu sein [16]. Um als potenzielles Pflanzenhormon in Betracht gezogen zu werden, muss ein Kandidatenmolekül bestimmte grundlegende Eigenschaften aufweisen. Dazu gehören Kenntnisse über Biosynthesewege, Rezeptoren und physiologische Wirkungen. Studien zum Biosyntheseweg von Melatonin in Pflanzen haben erhebliche Fortschritte gemacht. Diese zeigen Tryptophan (Trp) als Vorstufe, gefolgt von vier aufeinander folgenden Reaktionen mit den Enzymen Tryptophan-Decarboxylase (TDC), Tryptophan-5-Hydroxylase (T5H), Serotonin-n-Acetyltransferase (SNAT) und Acetyl-Serotonin-Methyltransferase (ASMT) [17, 18]. Dies wurde als Standardbiosyntheseweg in Pflanzen vorgeschlagen, wie z Arabidopsis thaliana und Reis (Zea mays) unter normalen Wachstumsbedingungen wurde jedoch auch vorgeschlagen, dass unter Bedingungen wie der Seneszenz ein alternativer Weg existiert, bei dem die Schlüsselenzyme SNAT und ASMT in ihrer Reihenfolge zur Produktion von Melatonin wechseln. Dies wurde auch als die am weitesten verbreitete Biosyntheseroute in Arabidopsis thaliana und Reis (Zea mays) im Vergleich zur klassischen Route [19]. Kürzlich wurde eine umgekehrte biosynthetische Reaktion mit einem Enzym n-Acetylserotonin-Deacetylase (ASDAC) wurde identifiziert in Arabidopsis thaliana und Reis, in dem Melatonin-Zwischenprodukt n-Acetylserotonin wird schnell in Serotonin umgewandelt. Diese Reaktion schränkt die Melatoninsynthese ein, wodurch ein optimaler Melatoninspiegel für ein ausgewogenes Pflanzenwachstum und eine ausgewogene Entwicklung aufrechterhalten wird [20]. Wie andere Pflanzenhormone übt Melatonin in Pflanzen mehrere physiologische Wirkungen aus, wie z. 21,22,23,24]. Kürzlich wurde der erste Melatoninrezeptor CAND2/PMTR1, ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, in Arabidopsis thaliana Es wurde gezeigt, dass es den durch Melatonin vermittelten Verschluss der Stomata reguliert [25]. Dies wurde lange gesucht, da ein Mangel an Melatoninrezeptoren in Pflanzen das vollständige Verständnis der Melatonin-vermittelten Signalübertragung behinderte. Ohne einen identifizierten Rezeptor war es auch eine Herausforderung, Melatonin als potenzielles Pflanzenhormon zu betrachten.

Neuere Studien haben das Crosstalk von Melatonin mit den bekannten Pflanzenhormonen wie Salicylsäure (SA), Abscisinsäure (ABA) und Ethylen untersucht [26]. Von besonderem Interesse war der Vergleich zwischen Melatonin und dem viel untersuchten Hormon Auxin wegen ihres gemeinsamen biosynthetischen Vorläufers, Tryptophan, der zu strukturellen Ähnlichkeiten führt, wie zum Beispiel einen Indolkern. Diese Ähnlichkeiten haben zu der Hypothese geführt, dass Melatonin auch auxinähnliche Aktivitäten im Sinne einer konzentrationsabhängigen Wachstumsregulierung teilen könnte. Das derzeitige Verständnis der Beziehung zwischen Melatonin und Auxin bleibt jedoch unklar. Frühere Studien mit Promotor-Reporter-Konstrukten, Genexpression und physiologischen Reaktionen unterstützen und widersprechen ähnliche Wirkmechanismen oder überlappende Signalwege zwischen Auxin und Melatonin. Zur Unterstützung ähnlicher Funktionen wurde berichtet, dass Melatonin das Pflanzenwachstum in niedrigen Konzentrationen (10 – 4 M, 10 – 7 M, 0,01 M) ähnlich wie Auxin stimuliert, indem es das Wurzelwachstum, die seitliche und zufällige Wurzelbildung in einer Vielzahl von Pflanzen erhöht Arten [6, 27, 28]. Ebenso in Wurzeln von Brassica juncea, Melatonin-Behandlung (0,1 μM) erhöhte die Konzentration von Indolessigsäure (IAA) und förderte das Wurzelwachstum [13, 29]. In transgenen Tomatenpflanzen, die das Schaf-Melatonin-Biosyntheseweg-Gen überexprimieren, Serotonin-N-Acetyltransferase (SNAT), führte zu einer Abnahme der IAA-Spiegel und zum Verlust der apikalen Dominanz [15, 30]. In ähnlicher Weise verringerte Melatonin die Transkripthäufigkeit von YUCCA (YUC) (YUC1, YUC2, YUC5, YUC6 und TAR2) Auxin-Biosynthesegene nach 600 μM Behandlung in Arabidopsis-Wurzeln [31]. Auxin-responsive Markierungslinien wie Direktwiederholung 5, DR5, wurden verwendet, um die Reaktion und Verteilung von Auxin in vielen Pflanzenarten wie Arabidopsis und Soja zu untersuchen [32]. DR5 ist ein synthetischer Promotor, der Auxin-responsive Elemente (AuxREs) enthält, und wird häufig als indirekter Marker der endogenen Auxin-Verteilung, -Signalgebung und -Reaktionen verwendet [33, 34]. Wang und Kollegen zeigten, dass die Behandlung von Arabidopsis-Wurzeln durch eine exogene Melatonin-Behandlung in einer hemmenden Konzentration (600 μM) verbessert wurde GFP und GUS Ausdruck von DR5 Zeilen [31]. Darüber hinaus zeigte eine RNA-Sequenzierungsanalyse von 10 und 20 μM Melatonin behandelten Wurzeln von 2 Wochen alten Reiskeimlingen, dass die Häufigkeit von Auxin-Signalgenen signifikant erhöht war [35]. Im Gegensatz zu obigen Studien haben Kim et al. (2016) berichteten über die Unfähigkeit von Melatonin (10 – 7 M–10 – 4 M), die Pflanzenreaktionen in Mais in den klassischen Bioassays zu stimulieren, die spezifisch verwendet werden, um die Auxin-Reaktionsfähigkeit zu demonstrieren, dh Verlängerung von Koleoptilen, Hemmung der Wurzeln in jungen Sämlingen und Induktion des Ethylen-Biosynthese-Gens, 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat (ACC)-Synthase [36]. Genexpressionsstudien in Arabidopsis-Pflanzen, die mit 100 pM und 1 mM Melatonin behandelt wurden, zeigten, dass die Transkripthäufigkeit der Auxin-Biosynthese und verwandter Gene mit Ausnahme eines Auxin-responsiven Gens nicht verändert wurde IAA-Aminosynthase, dies wurde bei Melatonin-Behandlung im Überfluss erhöht [37]. Es wurde gezeigt, dass die Behandlung mit Melatonin (5, 100, 450 und 500 μM) nicht in der Lage war, die Expression von Auxin-responsiven Markerlinien zu induzieren DR5: GUS in Arabidopsis Sämlinge [38, 39]. Die Daten aus diesen Studien weisen auf die gegensätzlichen Befunde zwischen und innerhalb von Pflanzenarten hin. Ein häufiger Störfaktor, insbesondere für die transkriptomische Analyse, war das Fehlen direkter Vergleiche zwischen Melatonin- und Auxin-Behandlungen unter identischen experimentellen Bedingungen.

Das Zusammenspiel von Melatonin und Mitochondrien wurde bei Säugetieren ausführlich untersucht, erst seit kurzem jedoch auch bei Pflanzen [40, 41]. Mitochondrien sind die Kraftwerke der Zellen und spielen eine Schlüsselrolle beim Wachstum und der Entwicklung von Pflanzen, indem sie die notwendigen Metaboliten, Enzymkofaktoren und Energie (ATP) bereitstellen. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Mitochondrien eine wesentliche Rolle bei der zellulären Signalübertragung spielen. Mitochondriale Signalübertragung oder mitochondriale retrograde Signalübertragung ergibt sich, wenn die Mitochondrienfunktion durch Stimuli gestört wird und dies zur Übertragung von Signalen führt, um die nukleäre Genexpression zu verändern [42]. Dies zeigt, dass Mitochondrien nicht nur für das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen entscheidend sind, sondern auch für die Reaktion auf biotischen und abiotischen Stress. Es ist daher nicht verwunderlich, dass eine Wechselwirkung zwischen mitochondrialen und hormonellen Signalwegen besteht, da Hormone stark mit Prozessen des Wachstums und der Stressabwehr verbunden sind [43]. Nukleare Gene, die mitochondriale Proteine ​​kodieren, haben sich auf der Grundlage einer Metaanalysestudie als auf eine Vielzahl von Hormonbehandlungen ansprechend gezeigt. Als wichtigste Regulatoren der mitochondrialen Funktion wurden die Pflanzenhormone Auxin, Cytokinin (CK), Jasmonsäure (JA) und Salicylsäure (SA) identifiziert [43]. Direktere zielgerichtete Ansätze haben eine Wechselwirkung zwischen diesen Hormonen und der mitochondrialen Signalübertragung gezeigt. Zum Beispiel wird die ABA-induzierte Signalübertragung von Schließzellen als Reaktion auf Trockenstress durch einen Pyruvat-Träger von Mitochondrien, der als bezeichnet wird, negativ reguliert Negativer Regulator der ABA-Signalgebung der Wachzelle 1, (NRGA1) in Arabidopsis thaliana [44]. Es hat sich gezeigt, dass die Behandlung mit Salicylsäure (SA) den mitochondrialen Elektronentransport in entkoppelt und hemmt Nicotiana tabacum [45]. Es wurde lange angenommen, dass Auxin und die mitochondriale Atmung einen Zusammenhang haben [46]. Darüber hinaus haben mehrere Studien einen Zusammenhang zwischen Auxin-Antworten und mitochondrialer Funktion gezeigt [47, 48]. Die Mutanten von Genen, die Proteine ​​kodieren, die an der Synthese der inneren mitochondrialen Membran beteiligt sind, wie Filamentation Temperature Sensitive H 4 (FTSH4) und PROHIBITIN3, hemmen die Auxin-Reaktion [49, 50]. Außerdem wurde Auxin im oxidativ abgebaut ftsh4 mutant durch Wasserstoffperoxid (H2Ö2)-Mediation, die als Strategie zur Priorisierung von Prozessen wie der Stressabwehr gegenüber wachstumsbezogenen Prozessen vorgeschlagen wird [51]. Antimycin A ist ein chemischer Stimulus für mitochondrialen Stress, der durch Blockierung des Komplexes III der mitochondrialen Atmungskette wirkt. Die Behandlung mit Antimycin A führte auch zu einem verringerten Auxin (IAA)-Spiegel und einer Herunterregulierung von Auxin-Rezeptoren und -Transportern wie den Auxin-Efflux-Transportern PIN1/3/4/7 in Arabidopsis thaliana [52, 53]. Außerdem war die Auxinhomöostase bei Mutanten des Gens IAA-Alanin-resistent 4 (IAR4) die eine mutmaßliche mitochondriale Pyruvat-Dehydrogenase E1-Alpha-Untereinheit kodiert, was auf ihre integrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Auxin-Homöostase hindeutet [54].

Alternative Oxidase (AOX) ist eine terminale Oxidase, die Teil der mitochondrialen Elektronentransportkette der Pflanze ist und die Atmung entkoppelt, indem sie die Protonenpumpenkomplexe III und IV umgeht, wodurch ein übermäßiger Ausbruch reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) reduziert wird. Diese Aktivität ist besonders dominant unter stressigen Umweltbedingungen wie Dürre, niedrige Temperaturen und bakterielle Infektionen durch Pseudomonas Spritzen wo Studien einen bemerkenswerten Anstieg des AOX-Transkripts und/oder -Proteins gezeigt haben [55]. Dies deutet darauf hin, dass eine breite Palette von Signalwegen AOX auslösen kann und daher als Marker für die mitochondriale retrograde Signalübertragung angesehen wird. Während eine Reihe von Pflanzenhormonen AOX wie SA und ET auslösen/induzieren können [45, 56], wirken andere wie Auxin antagonistisch auf die Induktion von AOX [52]. Es wurde gezeigt, dass die Anwendung von Auxin (4,5 μM NAA) die Antimycin A-vermittelte Induktion von Promotor-Reporter hemmt Alternative Oxidase1a (AOX1a::LUC) bei Arabidopsis [52]. Die antagonistische Beziehung von Auxin und mitochondrialer retrograder Signalübertragung spielt eine zentrale Rolle beim Ausgleich von Wachstums- und Stressreaktionen. Es wurde angenommen, dass Mitochondrien zusammen mit Chloroplasten die ursprünglichen Syntheseorte von Melatonin sind. Dies bezieht sich auf die endosymbiotische Theorie, bei der diese Organellen als Nachkommen von endosymbiotischen Bakterien angesehen werden, die Melatonin produzierten [57]. Vor kurzem wurde über die Synthese von Melatonin in Mitochondrien sowie Chloroplasten in Apfelblättern berichtet Malus zumi und Arabidopsis. Darüber hinaus sind Apfelmelatonin-Biosynthesegene Serotonin-N-Acetyltransferase SNAT und Acetylserotonin-O-Methyltransferase ASMT fanden sich in Mitochondrien bzw. Chloroplasten sowohl in Apfel als auch in Arabidopsis [41, 58]. Es fehlt jedoch an Verständnis dafür, wie Melatonin mit der mitochondrialen retrograden Signalübertragung und seiner Verwandtschaft mit Auxin funktioniert. Somit ist alternative Oxidase ein idealer Marker, um die Interaktion zwischen Auxin und Melatonin zu testen.

In dieser Studie wurden die Wirkungen von Melatonin direkt mit Auxin-Behandlungen verglichen. Zwei verschiedene transgene Arabidopsis-Linien, die induzierbare Promotor-Reporter-Konstrukte tragen, die auf Auxin ansprechen, wurden verwendet, um die Antwort von Pflanzen auf Melatonin gegenüber Auxin zu vergleichen. Direct Repeat 5 (grün fluoreszierendes Protein) DR5::GFP als Marker für die Auxinantwort und Alternative Oxidase1a (Luciferase) AOX1a::LUC als Marker für die mitochondriale retrograde Signalgebung verwendet [52, 59]. Darüber hinaus wurde das potenzielle molekulare Crosstalk zwischen Melatonin und Auxin mithilfe einer globalen Transkriptomanalyse von Arabidopsis-Rosettenblättern von Sämlingen untersucht, deren Wurzeln entweder mit Melatonin oder Auxin behandelt wurden.


Einführung

Bei Bakterien wird die Genregulation traditionell als adaptiver oder homöostatischer Mechanismus angesehen, der es der Zelle ermöglicht, auf veränderte Stoffwechselbedingungen oder Umweltbelastungen (z. B. Wall .) zu reagieren et al, 2004 Seshasayee et al, 2009). Der Grundgedanke ist, dass Proteine ​​nur bei Bedarf hergestellt werden sollten, um zelluläre Ressourcen zu schonen oder weil die Aktivität des Proteins unter anderen Bedingungen schädlich ist. Das klassische Beispiel ist die Induktion in Escherichia coli des lac Operon als Reaktion auf Laktose: das lac Operon ist für das Wachstum auf Laktose erforderlich, und die lac Operon wird in Abwesenheit von Laktose sehr schwach exprimiert. Wenn die lac Operon in Abwesenheit von Lactose künstlich induziert wird, indem dem Medium ein nicht metabolisierbares Lactose-Analogon zugesetzt wird, dann die Expression des lac Operon reduziert die Wachstumsrate. Diese Verringerung der Wachstumsrate spiegelt die Kosten für die Herstellung nutzloser Proteine ​​anstelle von nützlichen wider ( Stoebel et al, 2008 ) und auch die schädliche Aktivität der LacY-Permease unter bestimmten Bedingungen (Eames und Kortemme, 2012). Die relative Reduzierung in E coliDie Wachstumsrate von aufgrund der Produktion nutzloser Proteine ​​scheint je nach Wachstumsbedingungen zu variieren, aber unter Niedrigkostenbedingungen entsprechen die Kosten ungefähr dem Anteil des Gesamtproteins, der nutzlos ist ( Shachrai et al, 2010 ).

Obwohl viele spezifische Beispiele der Genregulation unter Laborbedingungen adaptiv zu sein scheinen, ist nicht klar, ob die Regulation der meisten Gene adaptiv ist. Genomweite Studien an Bakterien und Hefen haben eine geringe Korrelation zwischen Expressionsänderungen und der Bedeutung von Genen für die Fitness gefunden ( Birrell et al, 2002 Giaever et al, 2002 Schmied et al, 2006 Deutschbauer et al, 2011). Mit anderen Worten, die meisten Gene werden nicht herunterreguliert, wenn sie nicht für das Wachstum benötigt werden, und umgekehrt scheinen die meisten hochregulierten Gene für die Fitness nicht wichtig zu sein. Dies ist überraschend, da bei einem Kosten-Nutzen-Modell der optimalen Expression (Dekel und Alon, 2005) das optimale Expressionsniveau eines Gens bei geringem oder keinem Nutzen (oder Fitnessvorteil) viel niedriger ist als bei einem großen Nutzen. Daher gibt es ein Rätsel, warum die adaptive Regulation bei Bakterien nicht weiter verbreitet zu sein scheint.

Es gab mehrere Vorschläge, warum Gene exprimiert werden könnten, wenn sie für die Fitness nicht benötigt werden, oder warum sie möglicherweise nicht induziert werden, wenn sie benötigt werden. Genauer gesagt versuchen diese Theorien zu erklären, warum Bakterien mit scheinbar nicht-adaptiver Regulation nicht von anderen Bakterien mit optimalerer Regulation verdrängt wurden. Erstens könnten einige Gene im „Standby-Modus“ exprimiert werden, weil sie dem Bakterium beim Überleben helfen, wenn sich die Bedingungen ändern (Fischer und Sauer, 2005). Die Standby-Steuerung kann als eine Möglichkeit angesehen werden, die der adaptiven Steuerung innewohnende Verzögerung zu reduzieren. Wenn ein Gen unter adaptiver Kontrolle steht und überhaupt nicht exprimiert wird, wenn es nicht benötigt wird, dann, nachdem sich die Bedingungen ändern und es benötigt wird, gibt es eine Verzögerung, bis genügend Protein produziert wird, um sich an diese neue Bedingung anzupassen. Während dieser Verzögerung kann die Zelle aufhören zu wachsen oder sogar sterben. Somit impliziert die Ungewissheit über die nahe Zukunft eine gewisse Möglichkeit eines Nutzens aus der Expression eines Gens, das derzeit nicht benötigt wird. Wenn es eine signifikante Chance gibt, in der Zukunft einen Nutzen zu erzielen, dann wird der durchschnittliche zukünftige Nutzen die (bestimmten) Kosten für die Expression von nicht benötigtem Protein übersteigen, so dass das optimale Expressionsniveau über Null liegt, obwohl das Gen derzeit keinen Nutzen bietet. Umgekehrt, wenn das Gen derzeit benötigt wird, sich jedoch die Bedingungen in naher Zukunft ändern könnten, verringert dies den erwarteten Nutzen einer hohen Expression und verringert somit das optimale Expressionsniveau. Mit anderen Worten, eine optimale Standby-Steuerung sollte den dynamischen Ausdrucksbereich dämpfen, ohne das Muster zu ändern. (Ein detailliertes Beispiel finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1). Somit kann eine optimale Standby-Steuerung nicht erklären, warum es eine so geringe Korrelation zwischen relativer Expression (d. h. wenn Gene hochreguliert sind) und Mutantenfitness (d. h. wann sie für optimales Wachstum benötigt werden) gibt.

Eine zweite und verwandte Theorie besagt, dass Proteine, die nur in kleinen Mengen benötigt werden, konstitutiv exprimiert werden könnten, weil die Kosten der adaptiven Kontrolle, wie die Kosten für die Herstellung von Transkriptionsfaktoren, den Vorteil einer geringeren Herstellung des Proteins, wenn es nicht benötigt wird, übersteigen könnten (Wessely et al, 2011). Die Regulierungskosten scheinen gering zu sein – der LacI-Repressor ist beispielsweise nur mit 20–50 Kopien pro Zelle vorhanden ( Milo et al, 2010 ) – diese Theorie sollte daher nur für schwach exprimierte Gene gelten, bei denen die Kosten für eine unnötige Expression gering sind.

Eine dritte Theorie, die sich auf sich ändernde Bedingungen bezieht, ist, dass Mikroorganismen ein Umweltsignal verwenden könnten, um ein anderes zu „vorwegnehmen“ ( Tagkopoulos et al, 2008 Mitchell et al, 2009). Hier ist die Veränderung der Umgebung (etwas) vorhersehbar und nicht völlig zufällig. Zum Beispiel für ein Darmbakterium wie E coli, kann ein Temperaturanstieg darauf hinweisen, dass es aufgenommen wurde und bald eine anaerobe Umgebung erreichen wird ( Tagkopoulos et al, 2008 ), so könnten Gene für die anaerobe Atmung induziert werden, obwohl sie nicht unmittelbar nützlich sind. Es ist nicht klar, ob die antizipative Kontrolle der Expression bei Bakterien weit verbreitet ist.

Viertens kann es bei horizontal übertragenen Genen, die in Bakterien häufig vorkommen, an Regulation fehlen, da sie nicht genügend Zeit haben, um eine geeignete Regulation in ihrem aktuellen Wirt zu entwickeln (Lercher und Pal, 2008). Allerdings scheinen nur die zuletzt übertragenen Gene nicht reguliert zu werden (Lercher und Pal, 2008). Auch die Regulierung kann sich schnell entwickeln (Stone and Wray, 2001 Berg et al, 2004 ), kann die Regulierung über Transferereignisse hinweg erhalten bleiben ( Preis et al, 2008 ), und viele horizontal transferierte Gene werden durch mehrere Transkriptionsfaktoren komplex kontrolliert ( Price et al, 2008). Daher bezweifeln wir, dass ein horizontaler Gentransfer erklären könnte, warum es eine geringe Korrelation zwischen relativer Expression (d. h. Regulation) und der genomweiten Fitness der Mutanten gibt.

Fünftens könnte die Regulation einiger Gene suboptimal oder maladaptiv sein, da die Expressionsmuster dieser Gene keiner starken Selektion unterliegen. Genauer gesagt, wenn eine veränderte Regulierung das relative Wachstum um weniger als 1/ne pro Generation, wobei ne die effektive Größe der Bakterienpopulation ist und die Auswirkung auf das Wachstum über natürliche Umgebungen gemittelt wird, dann ist es unwahrscheinlich, dass diese veränderte Regulierung die Population übernimmt. Die selektiv neutrale Evolution könnte auch für einen Teil der Komplexität der Genregulation verantwortlich sein (Lynch, 2007). Beide Regulierungsstellen ( McCue et al, 2002 Rajewsky et al, 2002 ) und die Koexpression von Genen ( Price et al, 2007 ) sind normalerweise zwischen eng verwandten Bakterien konserviert, was bedeutet, dass die Regulation der meisten Gene einer gewissen Selektion unterliegt. Darüber hinaus in E coli, liegen über die Hälfte aller Gene in einer einzigen Bedingung mit über 0,1 mRNA pro Zelle vor, was 30–60 Proteinen pro Zelle entspricht ( Lu et al, 2007 ) oder über 1 von 100 000 aller Proteinmoleküle in der Zelle ( Milo et al, 2010). Da die Fitnesskosten einer unnötigen Expression eines Gens wahrscheinlich mindestens so groß sind wie sein Anteil am Gesamtprotein, bedeutet dies, dass die Fitnesskosten einer unnötigen Expression des typischen Gens mindestens 10 –5 pro Generation betragen. Dies entspricht ungefähr den geschätzten Fitnesskosten von Mutationen in der Codon-Nutzung, die ausgewählt werden (Bulmer, 1991). Somit sollte eine unnötige Expression des typischen Proteins unter Selektion sein.

Schließlich schlagen wir vor, dass die nicht-adaptive Regulation bei Bakterien, zumindest in Laborumgebungen, aufgrund von zwei Hauptfaktoren weit verbreitet ist. Erstens kodieren bakterielle Genome weit mehr Operons als Regulatoren. Im typischen Bakterium werden nur 4,2 % der Proteine ​​als Transkriptionsfaktoren vorhergesagt ( Charoensawan et al, 2010). Bei so wenigen Regulatoren werden die meisten Gene wahrscheinlich durch Faktoren reguliert, die nicht direkt mit ihrer Funktion zusammenhängen. Wir nennen diese Art der Regulierung indirekte Kontrolle. Beispielsweise werden bakterielle Gene oft durch „globale“ Transkriptionsfaktoren reguliert, die verschiedene und manchmal funktionell nicht verwandte Gene regulieren (Martinez-Antonio und Collado-Vides, 2003). Zweitens haben sich bakterielle Regulationssysteme unter ganz anderen Bedingungen entwickelt als denen, die im Labor getestet werden. Wenn die Nützlichkeit der Aktivität eines Gens mit einem funktionell nicht verwandten Signal korreliert, dann wird die Regulierung durch dieses Signal in der Wildnis ausgewählt, aber diese Korrelation wird wahrscheinlich unter künstlichen Bedingungen nicht aufrechterhalten. Wir erwarten also nicht, dass die indirekte Kontrolle, die sich in der Wildnis entwickelt hat, unter künstlichen Bedingungen adaptiv ist. Besteht dagegen ein direkter regulatorischer Zusammenhang zwischen einem Umweltsignal und der physiologischen Reaktion, wie bei der lac Operon, dann kann das Regulierungssystem auch außerhalb der Bedingungen funktionieren, unter denen es sich entwickelt hat.

Um diese verschiedenen Theorien der bakteriellen Genregulation zu testen, haben wir genomweite Mutantenfitnessdaten und Genexpressionsdaten des metallreduzierenden Bakteriums gesammelt Shewanella oneidensis MR-1 über 15 übereinstimmende Bedingungen. Wir haben auch große Kompendien von (nicht übereinstimmenden) Fitness- und Expressionsdaten für dieses Bakterium untersucht. Wir fanden heraus, dass 24% der Gene unter bestimmten Laborbedingungen die Fitness beeinträchtigen, was zeigt, dass die Regulation vieler Gene im Labor fehlangepasst ist. Wir bestätigten, dass die Korrelation zwischen relativer Expression und Mutantenfitness schwach ist, wie in unserer vorherigen Studie mit nur vier Bedingungen ( Deutschbauer et al, 2011). Wir schlossen einige technische Erklärungen für die schwache Korrelation aus, wie Wachstumsphaseneffekte auf die Expression, subtile Variationen der experimentellen Bedingungen oder genetische Redundanz aufgrund von Paralogen, und wir fanden kaum Hinweise auf eine vorausschauende Kontrolle. Als Beweis für die indirekte Kontrolle zeigen wir, dass viele Gene konstitutiv exprimiert werden, anstatt durch Transkriptionsfaktoren kontrolliert zu werden, oder durch die Wachstumsrate reguliert werden. Darüber hinaus scheint diese Regulation für viele Gene suboptimal zu sein und kann nicht durch Standby-Kontrolle erklärt werden. Wir zeigen auch, dass Gene mit eng verwandten Funktionen ziemlich unterschiedliche Expressionsmuster aufweisen können, was darauf hindeutet, dass einige von ihnen nicht direkt kontrolliert werden.

Um die Allgemeingültigkeit unserer Ergebnisse zu testen, haben wir die Expression und Mutantentauglichkeit von biosynthetischen Genen in vier verschiedenen Bakterien untersucht –S. oneidensis MR-1, E coli K-12, das ethanolproduzierende Bakterium Zymomonas mobilis ZM4 und das sulfatreduzierende Bakterium Desulfovibrio alaskensis G20. In E coli, Biosynthesegene, die für die Fitness in Minimalmedien, aber nicht in Rich Media erforderlich waren, wurden in Minimalmedien fast alle herunterreguliert, aber bei den anderen drei Bakterien war dies oft nicht der Fall. Wir verglichen auch Fitness- und Expressionsdaten für Z. mobilis ZM4 über 18 übereinstimmende Bedingungen und fand eine geringe Korrelation zwischen relativer Expression und Mutantenfitness in Z. mobilis ZM4. Wir schließen daraus, dass eine suboptimale Regulation bei Bakterien weit verbreitet ist, zumindest unter Laborbedingungen.


LOKALISIERUNG VON OSKAR mRNA IN DER FRÜHE DROSOPHILA EMBRYO

Während Drosophila Oogenese stellt die mRNA-Lokalisierung einen ersten Schlüsselschritt für die Etablierung der Körperachsen und die embryonale Musterung dar. Mehrere mRNAs mütterlichen Ursprungs, einschließlich bicoid, gurken und osk, werden von den Ammenzellen in die Eizelle transportiert und an unterschiedlichen Positionen innerhalb der Eizelle lokalisiert. Nach der Befruchtung liefern ihre lokal translatierten Proteinprodukte Positionsinformationen und bilden ein streng kontrolliertes transkriptionales Regulationsnetzwerk für die Segmentierung des Embryos [61]. Die Lokalisierung von mRNPs mit bicoid oder osk wurde sehr detailliert untersucht [11, 62] und umfasst Mikrotubuli-abhängige Motorproteine ​​wie Kinesin und Dynein [11]. Vor allem bei osk, sein Lokalisierungsprozess kann in mehrere Phasen unterteilt werden, einschließlich mRNA-Export aus dem Zellkern, Dynein-abhängiger Transport von osk von den Ammenzellen in die Eizelle und Kinesin-abhängiger Transport zum hinteren Pol der Eizelle. Es wurde eine Reihe von RNA-bindenden Proteinen beschrieben, die in trans wirken, um den Transport von den Ammenzellen in und innerhalb der Eizelle zu erleichtern [11]. Einige von ihnen dienen auch als translationaler Repressor während des Transportprozesses.

Während seiner gesamten Lebenszeit, von der Synthese in den Kernen der Ammenzellen bis zum Abbau am hinteren Pol der Eizelle, osk Transkript ist mit einer dynamischen Sammlung von Proteinen verbunden. Diese Faktoren orchestrieren die Synthese, Verarbeitung, den Export, die translationale Kontrolle, die Lokalisierung und den Abbau von osk mRNA. Funktionell relevantere trans-wirkende Faktoren sind bekannt für osk RNA als bei jedem anderen lokalisierten Transkript.

Während des Spleißens in mehrzelligen Eukaryoten wird ein großer Komplex aus mehreren Untereinheiten, der Exon-Junction-Komplex (EJC) genannt, stromaufwärts der Exon-Exon-Verbindung abgelagert. Während dieser Komplex im Allgemeinen als Kennzeichen für den Nonsense-vermittelten Zerfall von mRNAs mit vorzeitigen Stoppcodons dient [63], ist sein Zusammenbau stromaufwärts der ersten Exon-Exon-Verbindung essenziell für osk mRNA-Lokalisierung [64]. Diese Anforderung passt gut zu den genetischen Daten, die zeigen, dass osk von cDNA abgeleitete Reporter-mRNAs sind in Abwesenheit von endogenen osk mRNA. Neben den EJC-Komponenten können mehrere andere RNA-bindende Proteine, deren Funktionsverlust zu Defekten im osk Lokalisation, Shuttle zwischen Kern und Zytoplasma. Dazu gehören Proteine ​​der heterologen nuklearen RNP (hnRNP)-Familie wie Hrp48 und Squid/Hrp40. Während Hrp48 direkt an . bindet osk 5’- und 3’-UTR [65, 66], Hrp40 interagiert nur mit osk 3’-UTR, wo es auch an Hrp48 bindet [67]. Da viele hnRNP-Proteine ​​RNA co-transkriptionell binden [68], assemblieren Hrp40 und Hrp48 wahrscheinlich auch mit osk im Kern. Im Gegensatz zu anderen hnRNPs, die an binden osk, muss das Polypyrimidin-Trakt-bindende Protein (PTB)/hnRNP I nicht seine Ziel-mRNA im Zellkern binden. Diese Schlussfolgerung wurde aufgrund der Beobachtung gezogen, dass eine ausschließlich zytoplasmatische Variante der PTB in der Lage ist, mit osk und die endogene PTB funktionell ersetzen [69]. Im Gegensatz zu dem Drosophila Protein, die nukleare Assoziation der Xenopus laevis PTB-Homolog mit seinem Ziel Vg1 mRNA wurde als ein entscheidender Schritt bei der Lokalisierung vorgeschlagen [70]. Drosophila Die PTB bindet an mehrere Stellen innerhalb der osk 3’-UTR und vermittelt die Bildung großer Komplexe mit mehreren osk Moleküle [69]. Diese Anordnung könnte mindestens zwei Funktionen erfüllen, indem sie mehrere mRNA-Moleküle in mRNPs verpackt, um den effizienten Transport und die Repression von osk Translation durch Maskierung der mRNA von der Translationsmaschinerie.

Interessanterweise ist die Bildung von großen osk An RNA-Proteinpartikeln ist auch ein zweiter translationaler Repressor, Bruno, beteiligt [71]. Bruno enthält drei RNA-Erkennungsmotive (RRM), bindet an mehrere Stellen innerhalb osk 3’-UTR (Bruno response elements, BRE) und scheint die Übersetzung über zwei verschiedene Mechanismen zu unterdrücken. Zum einen rekrutiert Bruno Cup, einen Inhibitor der cap-abhängigen Translationsinitiation, der die Interaktion der Translationsinitiationsfaktoren eIF4E und eIF4G stört [72]. Auf der anderen Seite, in vitro Beobachtungen legen nahe, dass durch die Bindung an seine verwandten Stellen innerhalb von osk mRNA Das Protein baut die Transkripte in große 50-80S Translation-Silencing-Partikel ein [73]. Diese Verpackung der mRNA macht sie für den Translationsapparat unzugänglich. Hrp48 bindet ähnlich wie Bruno an BREs [66]. Lebensabbildung von osk RNP-Partikel haben kürzlich gezeigt, dass Hrp48 auch für die Bildung großer osk Partikel [74]. Zusätzliche Hinweise auf eine Funktion von BRE bei der Multimerisierung von osk mRNA stammt aus Beobachtungen, dass BRE-Elemente in trans wirken und die translationale Kontrolle auf koexprimierten osk mRNA-Mutanten, denen BREs fehlen [75]. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Idee, dass osk RNP-Partikel enthalten mehrere osk RNA-Moleküle mit ihren entsprechenden RNA-bindenden Proteinen. Neben der proteingetriebenen Multimerisierung deuten neue Daten auch darauf hin, dass die RNA-RNA-Interaktion zwischen einzelnen osk Moleküle könnten zur Bildung dieser großen Partikel beitragen. Eine Stem-Loop-Region innerhalb von osk 3’-UTR, die keine bekannte Bindungsstelle für die oben genannten Proteine ​​umfasst, reicht aus, um die Homodimerisierung von zwei voranzutreiben osk Nachrichten [76]. Together these data suggest that protein- as well as RNA-mediated formation of large particles is crucial, both for translational repression and transport of osk mRNA.

The large osk particles described above contain additional RNA binding proteins like Exuperantia (Exu) and Staufen (Stau). Exu lacks canonical RNA binding motifs but associates with osk mRNA and with many proteins involved in translational repression of osk [77]. Exu is required for proper osk mRNA localization and found in RNPs that display dynamic movements consistent with active transport. Staufen contains several double-stranded RNA binding domains (dsRBDs) and is involved in RNA localization in a number of organisms [78]. On one hand, genetic data provide evidence that it is involved in anchoring at the end of transport. On the other hand, Stau is a component of the large osk mRNPs already early on during microtubule-dependent transport [79]. Although in mammalian cells, at least a subfraction of both Staufen homologs, Stau1 and Stau2, shuttle between nucleus and cytoplasm [80], it has been demonstrated that XStau, the Xenopus homolog that participates in localization of Vg1 mRNA in oocytes, assembles with the RNA in the cytoplasm after nuclear export [70]. Ähnlich, Drosophila Stau associates with the mature osk particle in the cytoplasm, presumably after the transport of osk particles from the nurse cell to the oocyte [74]. In the oocyte, osk-containing mRNPs are localized to the posterior pole via active transport by microtubule-dependent motor proteins [74, 81]. The transport is at least in part mediated by the plus end directed motor kinesin-1. Interestingly, tracking of osk mRNPs in living oocytes has revealed that this transport corresponds to a random walk [81] and might actually reflect directed, motor-dependent movement along a weakly polarized microtubule network [82]. Transport is followed by anchoring or local entrapment at the oocyte’s posterior pole. This entrapment depends on components of the actomyosin system [83] but also on RNA binding proteins like Staufen.

In summary, the detailed analysis of osk mRNA localization has revealed that also in multicellular organisms multiple RNA-binding proteins participate in the localization of an mRNA and that nuclear events are important to guide cytoplasmic localization of transcripts. Some of the described proteins like Stau, Hrp48, or EJC components such as Barentz might have a more direct role in mRNA transport by e.g. recruiting different motor proteins (dynein or kinesin I) at various stages of localization. The involved RNA-binding proteins can have diverse but also overlapping functions during localization, ranging from translational control to particle formation and anchoring at the target site.


Diskussion

Expression microarrays are used to analyze molecular profiles of cancer in order to better understand the biological background of the disease. Another aim is to find new molecular markers, therapeutic targets, and/or new classification approaches that will enable better treatment of patients. Our study was intended to achieve both goals. We searched for gene expression patterns that may characterize histological types of ovarian cancer and are related to its histological grade, FIGO stage, response to chemotherapy, and survival times.

From the broad spectrum of features that we analyzed in our study, only histological type of the tumor was a factor, which showed a very strong impact on the gene expression pattern. Interestingly, there was one exception: six undifferentiated tumors that were available for this analysis, showed practically no difference in gene expression pattern from serous cancers. If confirmed in other studies, this may be an indication for evaluating these two groups together in microarray analyses.

On the contrary, the differences between serous/undifferentiated, endometrioid, and clear cell cancers were statistically highly significant. Moreover, the gene expression signature selected in respect to tumor histology allowed for a very precise sample classification, with the sensitivity and specificity not achieved in any other comparisons. Also unsupervised analysis, performed using the singular value decomposition (SVD) showed that histological type of the tumor is a major source of variability in the gene expression pattern in ovarian cancer (not shown). This large difference in gene expression pattern may be not surprising when we take into account that histological differences are clearly manifested at the morphological level and are easily distinguishable by light microscopy. On the other hand, these results, indicating deep molecular divergence, may support the current knowledge that ovarian cancer has a heterogeneous histological origin (e.g., fallopian, endometrioid, or endocervical) (28�).

The histology of ovarian cancer was already analyzed in many previous microarray studies (33�), however, it has not been regarded as a confounding factor in gene expression analysis in respect to other features. Conversely, different factors have been analyzed across various histological types. This may be one of the reasons for discrepancies and low reproducibility of the findings. Thus, a practical conclusion may be drawn that when searching for the genes related to other features of ovarian cancer, the analyses should be carried out on histologically homogenous groups of samples. Alternatively, the influence of the histological type on gene expression may be controlled by multivariate approach.

Except for evaluation of histological type, no other comparison gave such a huge number of statistically significant genes. This was the reason why we decided to use less stringent criteria for gene selection (uncorrected P-value π.001 and FDR 㰐%). Analyzing gene expression patterns in tumor samples of different grades, we focused mostly on the difference between grade 3 and 4, as the usage of the latter grade was abandoned in ovarian cancer diagnostics. A study performed by members of our group showed that the recognition of grade 4 might be important from the clinical viewpoint, since patients with grade 4 ovarian cancer had worse response to taxanes than to DNA-damaging agents (23). Thus, we expected that we would find differences between grade 3 and 4 also at the molecular level. However, samples classification was poor and in pairwise comparison we found only one gene with significantly changed expression (FDR 㰐%). It was surprising, as in ANOVA we found 152 probe sets (FDR 㰐%) differentiating between three grades (G2, G3, and G4), and this difference was also significant in the global test. In our opinion, this discrepancy may suggest that although tumor grade is generally associated with significant changes in gene expression pattern, the subjectively defined grades 3 and 4 may not reflect these differences. An additional factor influencing the results of this analysis may be the small and unequal size of the groups evaluated.

The problem also occurred when analyzing gene expression profiles in relation to FIGO stages and residual tumor size. These features were significant in the ANOVA and global tests, but the number of genes with different expression found in pairwise comparisons was low and the quality of classification was poor. The difference between FIGO II and FIGO III/IV was statistically significant, however, this result may be an artifact related to uneven samples distribution in the groups being compared.

As far as the residual tumor size is concerned, poor classification of tumor samples may be due to the fact that debulking status did not solely depend on the biological tumor profile, but also on the changing attitude to optimal debulking over several years during which our material was collected. Other factors influencing the results might be technical issues, such as skills of surgeons and the equipment available. Our samples came from mid 1990s (patients treated with platinum𠄼yclophosphamide, PC), and from early 2000s (patients treated with taxane–platinum, TP). The group treated with PC had been generally less radically operated than the group treated with TP (23). Thus, this may be the major reason why it was hard to obtain reliable results in gene expression analysis in respect to this parameter. In addition, the arbitrarily outlined classes (R0𠄲) may not reflect intrinsic biological differences.

The most important, from the clinical point of view, is the search for molecular markers suitable for prediction of tumor response to the therapy. In the presented analysis, we were not able to find a gene signature that would allow for good classification of samples sensitive and resistant to chemotherapy. It seems that chemosensitivity/resistance, in contrast to, e.g., histological type, is a feature that may depend on subtle molecular changes, possibly in many alternative pathways. Such differences may be hard to detect by the methods applied. It has been shown recently, by comparing the data from Cancer Cell Line Encyclopedia and Cancer Genome Project, that discrepancies in drug sensitivity testing are common even when performed on cell lines (41). Another reason for the failure of this analysis may be again the fact that we analyzed two cohorts of patients treated with different CHT regimens. Probably, different molecular pathways were engaged in tumor response to the two regimens and this could affect the results of our analyses. It was not advisable, however, to divide patients into two groups according to the CHT regimen, because this would result in biased results due to small classes of samples.

We also searched for genes that may be related to patients’ prognosis, i.e., DFS and OS. Only 4 out of 15 genes, selected in microarray analysis as associated with OS, were positively validated by qRT-PCR, and none were validated for DFS. Our further attempts to validate these four genes in the independent set of samples were unsuccessful. There may be several reasons for this result. First, all genes selected in respect to survival time were of low statistical significance in the microarray analysis. Second, contrarily to the initial group, the independent set of patients used for validation was uniformly treated with TP regimen only. Therefore, it might show results different from those obtained in the initial, mixed group. Indeed, we observed that the initial group of patients had different OS statistics than the test group (Table 6).

Table 6. Characteristics of the two groups of patients according to OS statistics (days).

In general, the results of qRT-PCR validation were surprising. Several genes that were selected as related to one feature appeared to correlate with another factor(s). In our opinion, this observation confirms that many clinical and biological features of the tumor are difficult to define and that arbitrarily assigned groups of samples used in gene expression analyses not always reflect biologically significant differences.

Our attempts to validate selected genes were rather unsuccessful. It should be noted, however, that we performed an external validation on the independent group of tumor samples, while many other studies that claim finding potential biomarkers, were confined just to the internal, technical validation [reviewed, e.g., in Ref. (2, 42)].

One of the most interesting genes selected in our study is CLASP1 (cytoplasmic linker associated protein 1). It was associated with both OS and DFS in the microarray analysis, although validation results were mixed. In the initial group of samples, it was validated in respect to OS and showed significant association with response to chemotherapy and with the presence of hereditary BRCA1 mutation. Surprisingly, when we tried to validate CLASP1 in the independent set of samples it was statistically insignificant in respect to OS, but it proved to be associated again with DFS. CLASP1 is thought to play a role in the regulation of microtubule dynamics in interphase and during cell division (43, 44). Thus, the protein may be important in tumor cell response to taxanes. Possibly, it may also be somehow engaged in differential response to CHT in patients with hereditary, BRCA1 mutation-linked ovarian cancer. Regardless of the inconsistent results of validation, we think that CLASP1 may be worth further investigation as a potential prognostic and predictive marker.


Why narcoleptics get fat

People with narcolepsy are not only excessively sleepy, but they are also prone to gaining weight. In fact, narcoleptic patients will often pack on pounds even as they eat considerably less than your average person.

Now researchers reporting in the October issue of Cell Metabolism, a Cell Press publication, appear to have an answer as to why. It seems a deficiency of the neuropeptide hormone orexin, an ingredient that encourages hunger and wakefulness, may leave them with a lack of energy-burning brown fat.

The findings may lead to orexin-based weight loss therapies for those with narcolepsy and for the rest of us, too, according to the researchers.

Orexins are rather unique in that they allow one to eat more and lose more at the same time, explained Devanjan Sikder of the Sanford-Burnham Research Institute. "It is a couch potato's dream."

Fat comes in one of two types: white or brown. White fat stores calories while brown fat burns them, generating heat in the process. There had been hints that orexins might influence body temperature, but it wasn't clear exactly how.

The new evidence in mice shows that orexins are critical for the formation of mature brown fat from its precursors. With too little orexin, animals' brown fat activity drops along with their energy expenditure. Likewise, mice injected with orexin show a substantial loss of fat.

The findings bolster the emerging concept that those with less active brown fat may be destined from birth, or even before, to be fatter. "They are somehow predisposed," Sikder said.

There are already ways of stimulating brown fat's production, but it isn't easy to do. For instance, more brown fat is produced when you spend a lot of time in the cold. The new findings suggest that orexin therapies might be useful for increasing brown fat and literally melting extra calories away.

"One caveat is that orexin might increase arousal," the researchers wrote, "although this is expected only under sleep deprived conditions."

Sikder says it will now also be worthwhile to examine orexin-deficient people with narcolepsy to find out whether their brown fat activity is indeed compromised.


Hintergrund

Transcript quantification has been a key component of RNA-seq analysis pipelines, and the most popular approaches (such as RSEM [1], kallisto [2], and Salmon [3]) estimate the abundance of individual transcripts by inference over a generative model from transcripts to observed reads. To generate a read in the model, a transcript is first sampled proportional to its relative abundance multiplied by length, then a fragment is sampled as a subsequence of the transcript according to bias correction models. The quantification algorithm thus takes the reference transcriptome and the set of reads as input and outputs a most probable set of relative abundances under the model. We focus on a generalization of the problem, called graph quantification, that allows for better handling of uncertainty in the reference transcriptome.

The concept of graph quantification was first proposed by Bernard et al. [4], which introduced a method called FlipFlop. Instead of a set of linear transcripts, a splice graph is given and every transcript compatible with the splice graph (a path from transcript start to termination in the splice graph) is assumed to be able to express reads. The goal is to infer the abundance of edges of the splice graph (or its extensions) under flow balance constraints. Transcript abundances are obtained by flow decomposition under this setup. FlipFlop infers network flow on its extension of splice graphs, called fragment graphs, and uses the model to further assemble transcripts. However, the proposed fragment graph model only retains its theoretical guarantee when the lengths of single-end reads or paired-end fragments are fixed. In this work, we propose an alternative approach to graph quantification that correctly addresses the variable-length reads and corrects for sequencing biases. Our method is based on flow inference on a different extension of the splice graph.

Modeling RNA-seq reads directly by network flow on splice graphs (or variants) is advantageous when the set of transcript sequences is uncertain or incomplete. It is unlikely that the set of reference transcripts is correct and complete for all genes in all tissues, and therefore, many transcriptome assembly methods have been developed for reconstructing a set of expressed transcripts from RNA-seq data [5,6,7,8], including FlipFlop [4]. Recent long-read sequencing confirms the expression of unannotated transcripts [9], but it also shows that the individual exons and splice junctions are relatively accurate. With incomplete reference transcripts but correct splice graphs, it is more appropriate to model RNA-seq reads directly by splice graph network flows compared to modeling using the abundances of an incomplete set of transcripts.

The network flow of graph quantification may be incorporated into other transcriptome assembly methods in addition to FlipFlop. StringTie [6] iteratively finds the heaviest path of a flow network constructed from splice graphs. A theoretical work by Shao et al. [10] studies the minimum path decomposition of splice graphs when the edge abundances satisfy flow balance constraints. Better network flow estimation on splice graphs inspires improvement of transcriptome assembly methods.

The splice graph flow itself is biologically meaningful as it indicates the relative usage of splice junctions. Estimates of these quantities can be used to study alternative splicing patterns under the incomplete reference assumption. PSG [11] pioneered this line of work but with a different abundance representation. It models splice junction usage by fixed-order Markov transition probabilities from one exon (or fixed number of predecessor exons) to its successor exon in the splice graph. It develops a statistical model to detect the difference in transition probability between two groups of samples. However, a fixed-order Markov chain has limitations: a small order cannot capture long-range phasing relationships, and a large order requires inferring a number of transition probabilities that are likely to lack sufficient read support. Markov models set the abundance of a transcript to the product of transition probabilities of its splice junctions, which implicitly places a strong constraint on the resulting transcriptome. Many other previous studies of splice junction usage depend on a list of reference transcripts and compute the widely used metric Percentage Spliced In (PSI) [12,13,14]. Under an incomplete reference assumption, the estimated network flow is a potential candidate to compute PSI and study alternative splicing usage.

A key challenge of graph quantification, especially for paired-end reads, is to incorporate the co-existence relationship among exons in transcripts. When a read spans multiple exons, the exons must co-exist in the transcript that generates this read. Such a co-existence relationship is called phasing, and the corresponding read is said to contain phasing information. For these reads, the flows of the spanned splice edges may be different from each other, and in this case, the probability of the read cannot be uniquely inferred from the original splice graph flow. FlipFlop solves this problem by expanding the splice graph into a fragment graph, assuming all reads are fixed-length. In a fragment graph, every vertex represents a phasing path, two vertices are connected if the phasing paths represented by the vertices differ by one exon, and every transcript on the splice graph maps to a path on the fragment graph. The mapped path in the fragment graph contains every possible phasing path from a read in the transcript, in ascending order of genomic location. However, it is not possible to construct this expansion of splice graphs when the reads or fragments are of variable lengths. There is no longer a clear total order over all phasing paths possible from a given transcript, and it is unclear how to order the phasing paths in a fragment graph. We detail the FlipFlop model in Additional file 1: Section 1.1.

To incorporate the phasing information from variable-length reads or fragments, we develop a dynamic unrolling technique over the splice graph with an Aho-Corasick automaton. The resulting graph is called a prefix graph. We prove that optimizing a network flow on the prefix graph is equivalent to optimizing abundances of reference transcripts using the state-of-the-art transcript expression quantification formulation when all full paths of splice graphs are provided as reference transcripts, assuming modeled biases of generating a fragment are determined by the fragment sequence itself regardless of which transcript it is from. In other words, quantification on prefix graphs generates exact quantification for the whole set of full splice graph paths. The proof is done by reparameterizing the sequencing read generation model from transcript abundances to edge abundances in the prefix graph. We also propose a specialized EM algorithm to efficiently infer a prefix graph flow that solves the graph quantification problem.

As a case study, we apply our method to paired-end RNA-seq data of bipolar disease samples and estimate flows for neurogenesis-related genes, which are known to have complex alternative splicing patterns and unannotated isoforms. We use this case study to demonstrate the applicability of our method to handle variable-length fragments. Additionally, the network flow leads to different PSI compared to the one computed with reference transcripts, suggesting reference completeness should be considered in alternative splicing analysis.


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Can we test the hypothesis that mitochondrial health = immune health and enhanced resistance to the virus?

In terms of testing and/or looking for evidence that mitochondria could help explain some of the pathophysiology of this virus, there are several potential ways to look for this relationship, ranging from laboratory based to population studies.

Direct evidence that SARs-CoV-2 modulates mitochondrial function

This work could be carried out in vitro with cultured cells and/or isolated mitochondria prepared from control and infected individuals. In particular, using imaging to look for co-localisation in “virus factories”.

Lifestyle and mitochondrial function

It could be predicted that those populations exhibiting the lowest levels of optimal health and the highest levels of the metabolic syndrome and “diabesity”, will show the highest susceptibility. For example, it might be revealing to map the case fatality rate to the latest trends in obesity/ diabetes after the necessary confounders are taken into account [284]. In support of this, the emerging data from New York in relation to SARS-CoV-2 infection is that obesity is strongly correlated with critical illness [9]. In contrast, would those populations showing the highest fitness levels and functioning be more resistant? For instance, would measured VO2 max show an inverse relationship with morbidity?

Inherited mitochondrial dysfunction

Individuals with known mitochondrial dysfunction are well known to show abnormal susceptibility to infections [25]. Is there a link between mitochondrial haplotype and resistance? There is certainly evidence for different mtDNA haplotypes amongst different populations [285]. Although there is an emerging disparity in morbidity between Black people and other minorities in the USA, it is thought it may be more to do with socio-economic imbalances and higher rates of lifestyle induced co-morbidities [286].

Markers of mitochondrial health in the blood

Blood-derived mitochondrial markers of reduced function may correlate with disease severity before, during and after infection.

Epigenetic age and mitochondrial function

Data now show it is possible to determine someone’s epigenetic age and compare it with their chronological age. There is a close correlation with this ratio and co-existing morbidity [287]. Thus, would blood-derived epigenetic markers of metabolic age correlate with disease severity before, during and after infection?


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